Réaliser des mesures d'absorbance

De manière schématique, le principe de fonctionnement du spectrophotomètre est le suivant.

Schéma de fonctionnement interne du spectrophotomètre

Le rôle du prisme est de séparer les diverses radiations (longueurs d’onde) qui ont été transmises à travers la cuve.

Le détecteur va quant à lui mesurer l’intensité lumineuse I transmise pour chacune de ces longueurs d’onde.

Pour chaque longueur d’onde , l’intensité I mesurée est comparée à I₀ pour estimer l’absorbance correspondante, ce qui permet d’établir le spectre UV-visible associé.

La mesure de l’absorbance d’une solution à une longueur d’onde donnée nécessite le matériel suivant :

• spectrophotomètre ;
• cuves.

Un spectrophotomètre

Pour régler la longueur d’onde  de la radiation qui va traverser la solution dans le spectrophotomètre, il faut taper la valeur de cette longueur d’onde à l’aide du clavier qui se trouve sur l’appareil.
Il faut respecter les étapes suivantes pour chaque mesure d’absorbance A.

1. Remplir au ¾ une cuve avec la solution à étudier.
2. Remplir au ¾ une autre cuve avec le solvant (de l’eau distillée pour les solutions aqueuses).
   Cette cuve va permettre de réaliser le réglage du blanc (ou le réglage du zéro) pour le spectrophotomètre, c'est-à-dire d’éliminer l’influence du solvant sur la valeur finale de l’absorbance A.
   
   Explication sur le réglage du blanc
   Une solution colorée est constituée d’une espèce responsable de la couleur, diluée dans un solvant (pour les solutions aqueuses, le solvant sera toujours l’eau). En effectuant le réglage du blanc, on ne prend pas en compte l’absorbance du solvant mais uniquement l’absorbance de l’espèce colorée.
3. Taper la longueur d’onde  pour laquelle on désire mesurer l’absorbance de la solution selon les valeurs demandées.
   
   Par exemple, la première valeur du tableau de valeurs ci-dessous est  = 400 nm.
   

   Longueur d'onde  (nm)	400	420	460	500	540
   Absorbance A

4. Introduire dans le spectrophotomètre la cuve qui contient le solvant (eau distillée).
5. Appuyer sur la touche « ZERO » afin de réaliser le réglage du blanc.
6. Remplacer la cuve qui contient l’eau distillée par celle qui contient la solution colorée étudiée.
7. Noter sur le tableau la valeur de l’absorbance A indiquée par le spectrophotomètre.
8. Procéder de la même manière avec les autres longueurs d’onde.